После чего вернулся в Уфу, где в разные годы трудился в Уфимском моторостроительном производственном объединении, Уфимском авиационном институте.

С 1986 по 19990 годы — заведующий лабораторией по наземному использованию авиадвигателей, затем – заведующий научно-производственным отделом Восточного филиала Всесоюзного НИИ по строительству магистральных трубопроводов (г. Уфа).

В 1990 году был избран депутатом Верховного Совета Башкирской АССР, где являлся председателем Комиссии Верховного Совета по экологии и рациональному использованию природных ресурсов.

С 1993 по 1994 год работал директором Института прикладной экологии и природопользования Республики Башкортостан.

В 1994-1996 годы возглавлял Министерство охраны окружающей среды, природопользования, предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций Республики Башкортостан.

С 1996 по 1999 год — Министр по чрезвычайным ситуациям и экологической безопасности Республики Башкортостан, член Совета Безопасности Республики Башкортостан.

В 1999 году возглавил Департамент предупреждений и ликвидации чрезвычайных ситуаций Министерства по чрезвычайным ситуациям Российской Федерации.

С 2000 по 2003 годы — главный федеральный инспектор по Республике Башкортостан аппарата полномочного представителя Президента Российской Федерации в Приволжском федеральном округе, затем исполняющий обязанности заместителя полномочного представителя Президента Российской Федерации в Приволжском федеральном округе.

В 2003-2004 годах – руководитель межрегиональной инспекции по крупнейшим налогоплательщикам, начальник Управления крупнейших налогоплательщиков Министерства Российской Федерации по налогам и сборам.

С 2004 по 2009 годы — руководитель Федерального агентства водных ресурсов. С 2009 года работал заместителем Председателя Правления ОАО «РусГидро».

С 19 июля 2010 года – Президент Республики Башкортостан.

14 сентября 2014 года по итогам досрочных выборов Президента Республики Башкортостан Рустэм Хамитов набрал 81,71 процента голосов избирателей и был переизбран на второй срок.

15 июля 2010 года Президент Российской Федерации Дмитрий Медведев принял отставку Президента Республики Башкортостан Муртазы Рахимова и назначил Рустэма Хамитова временно исполняющим обязанности руководителя региона.

19 июля 2010 года депутаты Государственного Собрания — Курултая Республики Башкортостан наделили Рустэма Хамитова полномочиями Президента Республики Башкортостан.

30 мая 2014 года Президент Российской Федерации Владимир Путин принял отставку Рустэма Хамитова, чтобы он смог принять участие в выборах главы региона.

14 сентября 2014 года по итогам досрочных выборов Президента Республики Башкортостан Рустэм Хамитов набрал 81,71 % голосов. Явка избирателей составила 74,88 %[34]. Вместе с тем некоторые общественные деятели подвергли сомнению официальные итоги выборов. Церемония инаугурации избранного руководителя региона состоялась 25 сентября 2014 года в Государственном Собрании — Курултае Республики Башкортостан.

С 1 января 2015 года — Глава Республики Башкортостан (должность переименована в соответствии с Федеральным законом «Об общих принципах организации законодательных (представительных) и исполнительных органов государственной власти субъектов РФ»).

С 20 июля 2010 года по 19 мая 2011 года, а затем с 6 августа 2012 года по 26 ноября 2015 года совмещал должности руководителя региона и Премьер-министра Правительства Республики Башкортостан.

11 октября 2018 года в День Республики Башкортостан подал заявление об оставке. Рустэм Хамитов отметил, что это его личное решение: «Я не планирую участие в выборах в 2019 году. По моему глубокому убеждению, руководители региона в зрелом возрасте должны своевременно принимать решение о завершении деятельности и должны уходить достойн. Башкортостан – замечательная республика. И я, вообще говоря, счастлив, что имел возможность вложить свой труд на благо нашего края»